蛋白酶K具有廣泛的底物特異性。即便存在洗滌劑的情況下，其仍可降解許多非變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)。蛋白酶K分離自一種可在角質(zhì)上生長的真菌白色側(cè)齒霉菌(Engyodontiumalbum)（前稱腐生真菌(Tritirachiumalbum)。因此，蛋白酶K能夠降解非變性狀態(tài)的角質(zhì)（頭發(fā)），因而稱為“蛋白酶K”。1其切割的主要位點(diǎn)為帶有封閉氨基基團(tuán)、鄰近脂族或芳香族氨基酸羧基端的肽鍵。因其廣泛的特異性，其較為常用。

　　蛋白酶K（ProteinaseK），相對分子量約為29.3kDa,是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，應(yīng)用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實(shí)驗(yàn)，蛋白酶K的一般工作濃度是50—100µg/ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根據(jù)所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內(nèi)（pH4-12.5）均有活性。

　　蛋白酶K有兩個Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶k消化過程中通常也加入EDTA（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/lCa2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l，以鰲合Ca2+。