細胞凍存和復(fù)蘇經(jīng)驗總結(jié)

2016/11/29　　閱讀(53)

    細胞凍存過程對保持細胞狀態(tài)影響巨大，李記生物結(jié)合多年實踐，總結(jié)出如下實用的細胞凍存流程。 “慢凍快融” 是細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則，這對zui大限度的保存細胞活力至關(guān)重要。目前細胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性；細胞凍存和復(fù)蘇時，減少細胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生是關(guān)鍵。緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的物理損傷。復(fù)蘇細胞采用快速融化的方法可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

細胞凍存操作流程：

1、細胞凍存前12~24h，換新鮮培養(yǎng)基，使細胞一直處于對數(shù)生長期。

2、待細胞長至80%匯合時胰酶消化，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細胞懸液，1000rpm離心10min。懸浮細胞則直接離心。

3、棄上清，加入凍存液重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細胞懸液分至凍存管內(nèi)，每管1~1.5mL，擰緊蓋子。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細胞名稱、凍存日期等。（細胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實驗室實際條件調(diào)整）

4、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存。也可使用程序降溫盒更為方便，細胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一晚，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次，以免影響凍存效果。

5、細胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存，為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存。

細胞復(fù)蘇操作流程：

1、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細胞能盡快通過zui易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5、將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。

對DMSO不敏感的細胞在復(fù)蘇時也可不離心，減少操作步驟，也可降低污染的幾率。將解凍的細胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加新鮮培養(yǎng)基，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基，移除死細胞。